舒韻1, 2, 閆茂成1, , 魏英華1, 劉福春1, 韓恩厚1, 柯偉1

1 中國科學院金屬研究所 沈陽 110016
2 中國科學技術大學材料科學與工程學院 沈陽 110016

摘要

關鍵詞： 微生物腐蝕 ; 管線鋼 ; 微區電化學技術 ; 生物膜 ; 硫酸鹽還原菌

微生物導致的腐蝕(MIC)在材料腐蝕失效中占重要比例。硫酸鹽還原菌(SRB)廣泛存在于土壤、海水及河水等自然環境中,是影響管道、油氣井等地下金屬設施MIC的主要厭氧菌[1,2]。一般認為SRB的呼吸過程為硫酸鹽呼吸,SRB以SO42-為電子受體氧化有機物,利用分子氫、脂肪酸、脂肪烴等有機物作為碳源和電子供體維持其生命所必需的能量[3],通過分泌胞外聚合物(EPS)形成生物膜黏附于金屬表面,加速材料的腐蝕。據報道,含SRB環境中碳鋼的點蝕速率高達0.7~7.4 mm/a[4]。

自1910年Gaines[5]首次報道MIC現象以來,人們對SRB環境中金屬材料的腐蝕行為進行了大量研究[6,7,8,9,10,11],但由于微生物過程的復雜性,對SRB的腐蝕機制仍不明確,目前廣泛接受的機理主要有陰極去極化理論[12]、濃差電池理論[13]、代謝產物理論[14,15]、陽極加速理論[16,17]和近年來提出的直接電子轉移理論[18,19,20,21,22]。近幾年來,SRB腐蝕研究主要集中于有機酸、H2S、FeS等代謝產物作用,生物膜作用,以及SRB細胞與Fe間的直接電子作用等。Jia等[23]提出胞外電子轉移方式主導SRB腐蝕過程。作者研究組的結果[24]表明,在SO42-匱乏環境中,SRB可調整呼吸代謝方式,轉而利用Fe(III)、Mn(IV)及H2等作為末端電子受體[25],進行胞外呼吸,維持生存代謝,促進碳鋼腐蝕的過程。盡管如此,目前人們對影響MIC過程的生物膜及其與膜下金屬交互作用等的認識仍然非常有限。

生物膜是細菌在自然環境中的主要生存方式,其對菌群形態、MIC行為等均有至關重要的影響。生物膜構建了微生物于惡劣環境中生存的一種保護模式,研究[26]表明,生物膜中細菌與浮游細胞的基因表達顯著不同;同時,生物膜與腐蝕產物Fe2+/Fe3+存在絡合、螯合作用,與金屬間存在直接或間接電子交互作用,但這些交互作用的具體過程和途徑尚不清晰。通過這些作用,微生物影響和改變了膜下金屬的腐蝕行為和電化學過程。

本工作針對海水中管線鋼的MIC過程,采用掃描電鏡(SEM)、X 射線光電子能譜(XPS)、掃描振動電極(SVET)、Raman光譜等表面形貌分析技術,結合極化掃描和電化學阻抗譜(EIS)等電化學測量技術,通過生物膜特征及金屬-介質-微生物膜間界面一些現象的表征,研究管線鋼在存在SRB的熱帶海水環境中的腐蝕行為,探討海水環境中SRB生物膜與X80鋼間的交互作用,及其對管線鋼腐蝕行為的影響。

1 實驗方法

1.1 實驗材料及介質

實驗用X80鋼的化學成分(質量分數,%)為: C 0.07,Mn 1.82,Si 0.19,P 0.007,S 0.023,Mo 0.23,Ni 0.17,Cr 0.026,Cu 0.020,V 0.002,Nb 0.056,Ti 0.012,Al 0.028,N 0.004,B 0.0001,Fe余量。電化學測量試樣的工作面積為10 mm×10 mm,厚度小于3 mm。試樣背面連接Cu導線,用環氧樹脂密封非工作面及導線連接處。水磨砂紙逐級打磨工作面至1000號,用去離子水沖洗及酒精清洗,吹干,存于干燥皿中備用。用于SVET測試的樣品預先鑲嵌在特制環氧樹脂中,打磨清洗吹干。

SRB取自渤海海泥,采用修正的Postage's C培養基對SRB進行富集培養。培養基的成分：每升溶液含0.5 g KH2PO4,1 g NH4Cl,0.06 g CaCl2 ?6H2O,0.06 g MgSO4 ?7H2O,6 mL 70% C3H5O3Na,1 g酵母汁,0.3 g C6H5Na3O7,0.06 g/L (NH4)2Fe(SO4)2。由NaOH溶液調pH值至7.0~7.2之間,通N2除氧及高壓滅菌鍋滅菌后,密封備用。SRB菌液于4 ℃下保存;實驗前在30 ℃下活化12 h。

實驗采用通N2除氧并滅菌處理的3.5%海水晶溶液。將富集培養并經活化后的SRB菌種按5%體積比加入到3.5%海水晶溶液中;滅菌對照組實驗將滅菌培養基按5%體積比加入到3.5%海水晶溶液中。實驗前實驗體系中所用溶液、容器、電極等均經高壓滅菌鍋或紫外燈照射滅菌處理,避免雜菌污染。

1.2 實驗方法

為研究X80鋼表面SRB生物膜的形成過程及其對鋼基體腐蝕的影響,進行周期為1、3、7和14 d的接菌浸泡實驗。實驗過程中,定時抽取溶液約1 mL,采用最大可能計數法(MPN)進行細菌計數。所有浸泡實驗均在30 ℃恒溫水浴鍋中進行。

開路電位(EOCP)及EIS等電化學測試在PARSTAT 2273電化學工作站上進行。測試采用三電極系統：工作電極為X80鋼,輔助電極為大面積Pt片,參比電極為飽和甘汞電極(SCE)。線性極化的掃描范圍為EOCP±20 mV,掃描速率為0.166 mV/s。EIS激勵信號為10 mV的正弦波,頻率范圍10-2~105 Hz,測量結果用ZSimpWin軟件進行擬合。

為研究SRB生物膜與鋼基體間的電化學交互作用,在生物膜局部劃傷處進行SVET微區電化學測試。接菌浸泡14 d后取出試樣,用美工刀在試樣表面生物膜劃一長1 mm的劃痕,露出基體金屬,在劃傷處進行SVET測試。測試采用Model 200型SVET系統,控制軟件為ASET 2.0。振動微電極是尖端鍍Pt的Pt/Ir合金絲。在SVET測試過程中,探針尖端距離樣品表面100 μm,掃描區域為3 mm×3 mm。SVET可以判斷出樣品表面上方溶液中電流為陽極電流還是陰極電流。

對用于生物膜形貌觀察的接菌試樣進行微生物固定及脫水處理[27]：用含3%戊二醛的磷酸緩沖鹽溶液固化0.5 h后,依次用PBS溶液和去離子水清洗2次,每次清洗5 min,然后再用50%、75%、95%和99%的酒精進行逐級脫水處理,每次10 min。脫水結束迅速吹干。用于表面元素分析的試樣進行酒精清洗、吹干即可。為觀察生物膜下試樣腐蝕形貌,將試樣在500 mL鹽酸+500 mL H2O+3.5 g六次甲基四胺中進行除銹處理。

采用XL30-FEG型SEM觀察試樣表面腐蝕形貌,由其自帶的能譜(EDS)分析腐蝕產物成分。采用SO-TN04顯微共聚焦Raman光譜儀分析腐蝕產物。采用ESCALAB 250型XPS確定腐蝕產物中S的化學狀態。高清S軌道譜在50 eV下獲取,通過標準C譜校準。

2 實驗結果和討論

2.1 SRB生物膜及腐蝕產物形貌

計數結果表明,SRB接菌海水中懸浮細菌數量隨時間的變化呈先升高后降低的趨勢。模擬海水的pH值在8左右,適宜SRB生長,因此起始階段SRB細菌數量呈指數上升,第5 d達到最大值,約2×108 cfu/mL。之后由于營養物質的消耗殆盡,細菌數量逐漸下降,到14 d時細菌數量降到了9.5×104 cfu/mL左右。

圖1為接菌海水中浸泡3、7和14 d后的X80鋼表面SRB生物膜及截面的SEM像。由圖可見,浸泡3 d后有些許絮狀腐蝕產物分布在試樣表面,疏松而不連續(圖1a)。由高倍SEM像可發現腐蝕產物同細菌一起黏附在EPS上,構成生物膜(圖1b)。白色絮狀物多為腐蝕產物,EDS顯示此處O含量高。隨浸泡時間延長,試樣表面腐蝕產物、細菌及EPS逐漸增多,7 d后呈團簇狀吸附聚集在試樣表面,但生物膜分布尚不連續(圖1d和e)。14 d后試樣表面可看到包裹著細菌和腐蝕產物的連續生物膜(圖1g和h)。有研究[28]表明,生物膜內細菌密度較懸浮狀態高出5~6個數量級。此過程中,生物膜從疏松到連續,其吸附作用源于相鄰細菌間的相互協同作用[29,30]。EPS可通過Van der Waals力、離子鍵、氫鍵吸附多種膠體顆粒,達到“架橋”作用,聚集微生物并引起細胞界面更大的吸附[31]。試樣表面生物膜的形成及其結構變化,導致基體表面電化學性質的不均勻性,為局部腐蝕的發生創造條件[28]。

圖1   接菌海水中浸泡3、7和14 d后X80鋼表面的SRB生物膜及截面SEM像

Fig.1   Low (a, d, g) and high (b, e, h) magnified surface SEM images and cross section SEM images (c, f, i) of SRB biofilm of X80 steel after 3 d (a~c), 7 d (d~f) and 14 d (g~i) exposed in inoculated seawater (SRB—sulfate-reducing bacteria, EPS—extracellular polymeric substance)

由截面可見,生物膜厚度隨時間的延長而增加(圖1c、f和i),膜的結構發生變化,EDS顯示S含量也隨時間延長而增多。由14 d后截面圖可觀察到,生物膜中腐蝕產物與EPS等交織在一起,較疏松的白色腐蝕產物膜由表面向膜下延伸,說明生物膜對產物Fe2+有吸附作用。這層疏松多孔膜中的FeS使金屬表面粗糙度增加,有利于細菌的附著及生物膜的形成[32]。

2.2 生物膜及腐蝕產物元素分析

接菌海水中試樣表面SRB生物膜/腐蝕產物的元素面掃描結果如圖2所示。由圖可見,X80鋼表面SRB生物膜主要由C、O、S、Fe等元素構成,其中,C、O、S等元素明顯富集,而Fe含量較基體明顯降低。S主要集中于SRB生物膜及其EPS上。實際上,細菌EPS一般包括多糖、蛋白質、核酸、脂質、磷脂和腐殖質等組分,其對生物膜內微生物有保護作用,可避免不利條件的影響。C及O大多集中在腐蝕產物(如Fe的氧化物)上,代謝產物如胞外聚合物上也有少量分布。生物膜與金屬存在相互作用,腐蝕產物也會存在于生物膜內,環境中的一些無機沉淀物(如沉積物或垢沉積)也是生物膜的一部分。

圖2   接菌海水中X80鋼上生物膜的SEM像及元素面分布圖

Fig.2   SEM image and distributions of elements on biofilm of X80 steel in inoculated seawater

圖3為X80鋼在接菌海水中及滅菌海水(對照組)浸泡14 d后腐蝕產物的Raman光譜。2種環境中在550 cm-1附近都出現了Raman峰,說明都有Fe3O4的產生,Fe3O4有較好的致密性和穩定性,是電導體,可參與還原反應。接菌環境中試樣在208和282 cm-1出現Raman峰,且隨時間推移強度升高,峰位向右輕微偏移。208 cm-1對應FeS特征譜線,屬點陣模型。282 cm-1處光譜峰是結構無序峰,屬于非晶體硫化亞鐵微晶中Fe-S鍵不對稱伸縮振動模型,與文獻[33]報道FeS的Raman譜一致。此外,380 cm-1處Raman峰的出現對應γ-FeOOH的特征峰,說明γ-FeOOH等腐蝕產物的產生。接菌3 d時可檢測到FeSO4峰的存在,而后期該峰消失,說明SO42-濃度減少。

圖3   滅菌及接菌海水中浸泡后X80鋼腐蝕產物的Raman光譜

Fig.3   Raman spectra of the corrosion production of X80 steel after 14 d exposed in the sterile and SRB inoculated seawater

圖4分別為接菌環境中浸泡1、7和14 d的樣品表面S的XPS精細譜。結合能較高的軌道峰對應于S的氧化態,結合能較低的軌道峰對應于S的還原態[34]。由擬合結果可知,隨時間延長,S譜峰值向低結合能方向移動,根據文獻[35,36,37,38,39,40,41]確定S的化合價態,對應硫化物示于圖中。S元素化合價由+6價向-2價偏移,硫酸鹽或亞硫酸鹽被SRB還原為低價硫化物。且低價S軌道峰隨時間延長而增加,尤其第7 d后更為明顯,與菌數量變化相對應,說明接菌條件下SRB的生理活動導致S化合價態降低。精細譜擬合結果中,化合物子峰對應的面積與其含量正相關,通過歸一化處理定量分析,各硫化合物占比列于表1。如表1所示,實驗初期S主要存在于SO42-中,隨著時間的延長而增加,SO42-逐漸轉化為S2-,浸泡7和14 d后S2-的占比分別為30.48%和37.89%。

圖4   接菌環境中浸泡1、7和14 d后樣品表面腐蝕產物中S的XPS精細譜

Fig.4   S spectra of X80 steel after 1 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in the SRB inoculated seawater

浸泡3、7和14 d后SRB生物膜下試樣表面的腐蝕形貌示于圖5?？梢?實驗3 d后試樣表面腐蝕輕微(圖5a),隨著浸泡時間的延長,開始出現明顯的局部腐蝕(圖5b)。有研究表明,低濃度的EPS在碳鋼表面吸附成膜抑制陰極反應過程,抑制碳鋼的腐蝕[42];高濃度的EPS對Fe2+具有絡合作用,能夠促進基體材料的陽極溶解[43]。實驗14 d時,出現一些較大的點蝕坑,整個表面出現大量的微小腐蝕坑(圖5c)。這說明連續完整的生物膜對均勻腐蝕有減緩作用,但促進了局部腐蝕的發生和發展,這是EPS及生物膜的屏障作用,不均勻分布[44],及其絡合Fe2+/Fe3+等綜合作用的結果。

圖5   接菌海水中浸泡3、7和14 d 后SRB生物膜下X80鋼的腐蝕形貌

Fig.5   Corrosion morphologies of X80 steel beneath SRB biofilm after 3 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in inoculated seawater

2.3 SVET測試

X80鋼表面SRB生物膜劃痕破損處微區SVET電流密度分布如圖6所示。SRB生物膜破損處基體為陽極區,陽極電流密度最高達36 μA/cm2;而劃痕周圍生物膜為陰極區,測試范圍內最大陰極電流密度為36 μA/cm2。SVET電流分布說明該MIC腐蝕體系中,生物膜與鋼基材間存在局部電化學耦合作用。這種局部耦合作用可能源于生物膜對Fe2+/Fe3+存在絡合/螯合作用[43],與金屬間存在直接或間接電子交互作用,促進基體的局部腐蝕。

圖6   接菌海水中浸泡14 d后X80鋼表面SRB生物膜劃傷處的SVET電流分布圖(電流密度(i)正值為陽極區,負值為陰極區)

Fig.6   SVET images of X80 steel on a scratch of SRB biofilm after 14 d exposed in inoculated seawater (The current density (i) is positive value in the anode region, whereas it is negative in the cathode region)

2.4 開路電位

圖7為X80鋼在滅菌和接菌海水中的EOCP隨浸泡時間的變化。滅菌海水中EOCP初始為-720 mV左右,1 d后下降到-735 mV左右,保持2 d后開始上升,恢復到-720 mV左右,這可能由于腐蝕產物積聚所致。接菌海水中,EOCP從初始的-730 mV降低到-738 mV,保持幾天后最終下降至-750 mV左右。可見,2種條件下的EOCP差異從第5 d開始變大,從第7 d開始EOCP保持恒定,且差異保持在30 mV左右,此時接菌試樣EOCP的變化與菌數量變化規律呈對應關系,這體現了SRB生物膜的電活性特征[7,19]。隨著浸泡時間的延長,腐蝕產物和代謝產物不斷積累,導電性增強,促進鋼表面電子轉移,導致EOCP降低。

圖7   滅菌和接菌海水中X80鋼開路電位隨時間的變化

Fig.7   Open circuit potential (EOCP) of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater as a function of time

2.5 電化學阻抗譜及極化電阻

圖8為滅菌和接菌海水中X80鋼的EIS結果。由Nyquist圖可見,由于培養基和腐蝕產物影響,滅菌海水中EIS從第3 d起阻抗弧半徑大幅增加(圖8a)。隨容抗弧增大,Bode圖中低頻阻抗模值|Z|0.01 Hz增大,最大相位角對應頻率減小(圖8c),Bode曲線向低頻移動,這與逐漸增多的腐蝕產物膜有關。Bode圖中|Z|0.01 Hz與Faraday過程相關,其絕對值與腐蝕速率呈負相關。

圖8   滅菌海水和接菌海水中X80鋼的Nyquist和Bode圖

Fig.8   Nyquist (a, b) and Bode (c, d) plots of X80 steel in the sterile seawater (a, c) and inoculated (b, d) seawater

由接菌海水中的Nyquist及Bode圖(圖8b和d)可見,前3 d阻抗大于滅菌條件,但3 d后低于滅菌海水中阻抗。第7 d起阻抗降低,反映了SRB對X80鋼腐蝕過程的促進作用。接菌的Bode圖中相位角峰值對應頻率不斷向低頻移動,移動范圍大于滅菌環境,一般認為這種相位角移動是試樣表面出現腐蝕的表現[45]。說明接菌海水中金屬與混合膜界面發生變化,SRB在浸泡實驗前期對腐蝕起抑制作用,后期卻促進腐蝕。

一般而言,EIS中的低頻電阻與Faraday反應過程有關,高頻電阻與溶液電阻有關。前者反映出鋼的腐蝕反應,后者代表了電解質的溶液電阻。故低頻阻抗模值可用于表征腐蝕過程的電化學動力學參數。本工作中,極化電阻Rp由下式獲得：

${?}_{\mathrm{p}}=|?{|}_{0.01\mathrm{Hz}}-|?{|}_{10\mathrm{kHz}}$(1)

式中,|Z|0.01 Hz和|Z|10 kHz分別為0.01 Hz和10 kHz處的阻抗模。由Stern方程[46]icorr=B×Rp-1 (其中,icorr為腐蝕電流密度,B為常數)可見,Rp與腐蝕速率負相關,Rp-1可反映腐蝕速率的變化趨勢。

圖9為實驗過程中X80鋼的Rp隨時間的變化規律。可以看出,實驗初期,滅菌海水中X80鋼的Rp隨時間快速升高,至第3 d達到穩定。接菌海水中,實驗前4 d Rp基本穩定,第5 d開始下降。實驗前3 d,接菌海水中Rp高于滅菌條件,即腐蝕速率低于滅菌條件;而3 d后,接菌海水中腐蝕速率高于滅菌條件;且浸泡實驗后期,接菌海水中的腐蝕速率約為滅菌海水中的10倍(Rp低約1個數量級)。各階段Rp、SRB數量及EOCP的變化呈對應關系,說明SRB達一定數量后其代謝產物、胞外聚合物等對試樣腐蝕速率起到促進作用。

圖9   滅菌和接菌海水中X80鋼極化電阻(Rp)隨時間的變化

Fig.9   Polarization resistance (Rp) vs time of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater

2.6 分析討論

生物膜是細菌在自然環境中的主要生存方式。微生物群落在水環境中通過浸潤表面、細胞生長、復制、吸附、微菌落形成和EPS發展等過程形成生物膜。圖10給出了海水中生物膜形成及X80鋼的腐蝕過程示意圖。實驗初期(圖10a)細菌主要以浮游態存在于溶液中,數量較少,但其逐漸吸附于鋼表面形成微生物菌落并生成EPS,EPS基質對腐蝕離子起一定阻隔作用;同時,EPS有電負性特征,能排斥侵蝕性負離子,抑制X80鋼的腐蝕。隨著細菌快速增殖,產生大量EPS,形成不均勻的生物膜(圖10b)。細菌的直接電子作用[20]和不均勻分布的生物膜引起濃差電池都可誘發和促進局部腐蝕。同時S2-與Fe2+反應生成FeS附著在基體表面,可與基體形成局部腐蝕電池,誘發點蝕坑的生成[34]。浸泡后期(圖10c),SRB代謝產物與腐蝕產物沉積在鋼表面,微生物菌落相互連接成完整生物膜,對均勻腐蝕過程有一定的抑制作用。但生物膜疏松多孔,其包裹的菌及大量的FeS,增加其導電性的同時還促進點蝕的發展,生物膜下酸量的增加也促進腐蝕。SVET結果也顯示,生物膜參與陰極過程,從而促進基體腐蝕的發展。

圖10   含SRB海水中管線鋼表面生物膜形成及膜下MIC腐蝕過程示意圖

Fig.10   Schematics of biofilm formation and corrosion process at the early stage (a), middle stage (b) and final stage (c) of X80 steel in SRB inoculated seawater

3 結論

(1) X80鋼在含SRB海水浸泡過程中,SRB細胞附著期及生物膜形成初期,EPS的屏障作用抑制X80鋼的腐蝕過程;但后期SRB的呼吸代謝活動導致X80鋼的自然腐蝕電位降低約20 mV,并顯著促進了管線鋼的局部腐蝕過程。

(2) 由EIS測試結果推測,含SRB海水中浸泡后期X80鋼的腐蝕速率較滅菌對照組高約1個數量級。SRB及其生物膜的作用致使X80管線鋼發生嚴重點蝕。

(3) 海水中SRB代謝過程促進S從SO42-向S2-轉變,并以FeS的形式在生物膜中沉積。生物膜作為陰極覆蓋在試樣表面,其與腐蝕產物間的絡合、螯合作用,細胞及其代謝產物、生物膜與金屬間存在直接或間接電子交互作用,這些作用相互協同耦合,促使生物膜下局部腐蝕的發生和發展。

來源--金屬學報