舒韻1,2,閆茂成1,,魏英華1,劉福春1,韓恩厚1,柯偉1

1 中國科學院金屬研究所 沈陽 110016
2 中國科學技術大學材料科學與工程學院 沈陽 110016

摘要

關鍵詞：微生物腐蝕;管線鋼;微區(qū)電化學技術;生物膜;硫酸鹽還原菌

微生物導致的腐蝕(MIC)在材料腐蝕失效中占重要比例。硫酸鹽還原菌(SRB)廣泛存在于土壤、海水及河水等自然環(huán)境中,是影響管道、油氣井等地下金屬設施MIC的主要厭氧菌[1,2]。一般認為SRB的呼吸過程為硫酸鹽呼吸,SRB以SO42-為電子受體氧化有機物,利用分子氫、脂肪酸、脂肪烴等有機物作為碳源和電子供體維持其生命所必需的能量[3],通過分泌胞外聚合物(EPS)形成生物膜黏附于金屬表面,加速材料的腐蝕。據報道,含SRB環(huán)境中碳鋼的點蝕速率高達0.7~7.4 mm/a[4]。

自1910年Gaines[5]首次報道MIC現象以來,人們對SRB環(huán)境中金屬材料的腐蝕行為進行了大量研究[6,7,8,9,10,11],但由于微生物過程的復雜性,對SRB的腐蝕機制仍不明確,目前廣泛接受的機理主要有陰極去極化理論[12]、濃差電池理論[13]、代謝產物理論[14,15]、陽極加速理論[16,17]和近年來提出的直接電子轉移理論[18,19,20,21,22]。近幾年來,SRB腐蝕研究主要集中于有機酸、H2S、FeS等代謝產物作用,生物膜作用,以及SRB細胞與Fe間的直接電子作用等。Jia等[23]提出胞外電子轉移方式主導SRB腐蝕過程。作者研究組的結果[24]表明,在SO42-匱乏環(huán)境中,SRB可調整呼吸代謝方式,轉而利用Fe(III)、Mn(IV)及H2等作為末端電子受體[25],進行胞外呼吸,維持生存代謝,促進碳鋼腐蝕的過程。盡管如此,目前人們對影響MIC過程的生物膜及其與膜下金屬交互作用等的認識仍然非常有限。

生物膜是細菌在自然環(huán)境中的主要生存方式,其對菌群形態(tài)、MIC行為等均有至關重要的影響。生物膜構建了微生物于惡劣環(huán)境中生存的一種保護模式,研究[26]表明,生物膜中細菌與浮游細胞的基因表達顯著不同;同時,生物膜與腐蝕產物Fe2+/Fe3+存在絡合、螯合作用,與金屬間存在直接或間接電子交互作用,但這些交互作用的具體過程和途徑尚不清晰。通過這些作用,微生物影響和改變了膜下金屬的腐蝕行為和電化學過程。

本工作針對海水中管線鋼的MIC過程,采用掃描電鏡(SEM)、X 射線光電子能譜(XPS)、掃描振動電極(SVET)、Raman光譜等表面形貌分析技術,結合極化掃描和電化學阻抗譜(EIS)等電化學測量技術,通過生物膜特征及金屬-介質-微生物膜間界面一些現象的表征,研究管線鋼在存在SRB的熱帶海水環(huán)境中的腐蝕行為,探討海水環(huán)境中SRB生物膜與X80鋼間的交互作用,及其對管線鋼腐蝕行為的影響。

1 實驗方法

1.1 實驗材料及介質

實驗用X80鋼的化學成分(質量分數,%)為: C 0.07,Mn 1.82,Si 0.19,P 0.007,S 0.023,Mo 0.23,Ni 0.17,Cr 0.026,Cu 0.020,V 0.002,Nb 0.056,Ti 0.012,Al 0.028,N 0.004,B 0.0001,Fe余量。電化學測量試樣的工作面積為10 mm×10 mm,厚度小于3 mm。試樣背面連接Cu導線,用環(huán)氧樹脂密封非工作面及導線連接處。水磨砂紙逐級打磨工作面至1000號,用去離子水沖洗及酒精清洗,吹干,存于干燥皿中備用。用于SVET測試的樣品預先鑲嵌在特制環(huán)氧樹脂中,打磨清洗吹干。

SRB取自渤海海泥,采用修正的Postage's C培養(yǎng)基對SRB進行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)基的成分：每升溶液含0.5 g KH2PO4,1 g NH4Cl,0.06 g CaCl2 ?6H2O,0.06 g MgSO4 ?7H2O,6 mL 70% C3H5O3Na,1 g酵母汁,0.3 g C6H5Na3O7,0.06 g/L (NH4)2Fe(SO4)2。由NaOH溶液調pH值至7.0~7.2之間,通N2除氧及高壓滅菌鍋滅菌后,密封備用。SRB菌液于4 ℃下保存;實驗前在30 ℃下活化12 h。

實驗采用通N2除氧并滅菌處理的3.5%海水晶溶液。將富集培養(yǎng)并經活化后的SRB菌種按5%體積比加入到3.5%海水晶溶液中;滅菌對照組實驗將滅菌培養(yǎng)基按5%體積比加入到3.5%海水晶溶液中。實驗前實驗體系中所用溶液、容器、電極等均經高壓滅菌鍋或紫外燈照射滅菌處理,避免雜菌污染。

1.2 實驗方法

為研究X80鋼表面SRB生物膜的形成過程及其對鋼基體腐蝕的影響,進行周期為1、3、7和14 d的接菌浸泡實驗。實驗過程中,定時抽取溶液約1 mL,采用最大可能計數法(MPN)進行細菌計數。所有浸泡實驗均在30 ℃恒溫水浴鍋中進行。

開路電位(EOCP)及EIS等電化學測試在PARSTAT 2273電化學工作站上進行。測試采用三電極系統(tǒng)：工作電極為X80鋼,輔助電極為大面積Pt片,參比電極為飽和甘汞電極(SCE)。線性極化的掃描范圍為EOCP±20 mV,掃描速率為0.166 mV/s。EIS激勵信號為10 mV的正弦波,頻率范圍10-2~105Hz,測量結果用ZSimpWin軟件進行擬合。

為研究SRB生物膜與鋼基體間的電化學交互作用,在生物膜局部劃傷處進行SVET微區(qū)電化學測試。接菌浸泡14 d后取出試樣,用美工刀在試樣表面生物膜劃一長1 mm的劃痕,露出基體金屬,在劃傷處進行SVET測試。測試采用Model 200型SVET系統(tǒng),控制軟件為ASET 2.0。振動微電極是尖端鍍Pt的Pt/Ir合金絲。在SVET測試過程中,探針尖端距離樣品表面100 μm,掃描區(qū)域為3 mm×3 mm。SVET可以判斷出樣品表面上方溶液中電流為陽極電流還是陰極電流。

對用于生物膜形貌觀察的接菌試樣進行微生物固定及脫水處理[27]：用含3%戊二醛的磷酸緩沖鹽溶液固化0.5 h后,依次用PBS溶液和去離子水清洗2次,每次清洗5 min,然后再用50%、75%、95%和99%的酒精進行逐級脫水處理,每次10 min。脫水結束迅速吹干。用于表面元素分析的試樣進行酒精清洗、吹干即可。為觀察生物膜下試樣腐蝕形貌,將試樣在500 mL鹽酸+500 mL H2O+3.5 g六次甲基四胺中進行除銹處理。

采用XL30-FEG型SEM觀察試樣表面腐蝕形貌,由其自帶的能譜(EDS)分析腐蝕產物成分。采用SO-TN04顯微共聚焦Raman光譜儀分析腐蝕產物。采用ESCALAB 250型XPS確定腐蝕產物中S的化學狀態(tài)。高清S軌道譜在50 eV下獲取,通過標準C譜校準。

2 實驗結果和討論

2.1 SRB生物膜及腐蝕產物形貌

計數結果表明,SRB接菌海水中懸浮細菌數量隨時間的變化呈先升高后降低的趨勢。模擬海水的pH值在8左右,適宜SRB生長,因此起始階段SRB細菌數量呈指數上升,第5 d達到最大值,約2×108cfu/mL。之后由于營養(yǎng)物質的消耗殆盡,細菌數量逐漸下降,到14 d時細菌數量降到了9.5×104cfu/mL左右。

圖1為接菌海水中浸泡3、7和14 d后的X80鋼表面SRB生物膜及截面的SEM像。由圖可見,浸泡3 d后有些許絮狀腐蝕產物分布在試樣表面,疏松而不連續(xù)(圖1a)。由高倍SEM像可發(fā)現腐蝕產物同細菌一起黏附在EPS上,構成生物膜(圖1b)。白色絮狀物多為腐蝕產物,EDS顯示此處O含量高。隨浸泡時間延長,試樣表面腐蝕產物、細菌及EPS逐漸增多,7 d后呈團簇狀吸附聚集在試樣表面,但生物膜分布尚不連續(xù)(圖1d和e)。14 d后試樣表面可看到包裹著細菌和腐蝕產物的連續(xù)生物膜(圖1g和h)。有研究[28]表明,生物膜內細菌密度較懸浮狀態(tài)高出5~6個數量級。此過程中,生物膜從疏松到連續(xù),其吸附作用源于相鄰細菌間的相互協(xié)同作用[29,30]。EPS可通過Van der Waals力、離子鍵、氫鍵吸附多種膠體顆粒,達到“架橋”作用,聚集微生物并引起細胞界面更大的吸附[31]。試樣表面生物膜的形成及其結構變化,導致基體表面電化學性質的不均勻性,為局部腐蝕的發(fā)生創(chuàng)造條件[28]。

圖1接菌海水中浸泡3、7和14 d后X80鋼表面的SRB生物膜及截面SEM像

Fig.1Low (a, d, g) and high (b, e, h) magnified surface SEM images and cross section SEM images (c, f, i) of SRB biofilm of X80 steel after 3 d (a~c), 7 d (d~f) and 14 d (g~i) exposed in inoculated seawater (SRB—sulfate-reducing bacteria, EPS—extracellular polymeric substance)

由截面可見,生物膜厚度隨時間的延長而增加(圖1c、f和i),膜的結構發(fā)生變化,EDS顯示S含量也隨時間延長而增多。由14 d后截面圖可觀察到,生物膜中腐蝕產物與EPS等交織在一起,較疏松的白色腐蝕產物膜由表面向膜下延伸,說明生物膜對產物Fe2+有吸附作用。這層疏松多孔膜中的FeS使金屬表面粗糙度增加,有利于細菌的附著及生物膜的形成[32]。

2.2 生物膜及腐蝕產物元素分析

接菌海水中試樣表面SRB生物膜/腐蝕產物的元素面掃描結果如圖2所示。由圖可見,X80鋼表面SRB生物膜主要由C、O、S、Fe等元素構成,其中,C、O、S等元素明顯富集,而Fe含量較基體明顯降低。S主要集中于SRB生物膜及其EPS上。實際上,細菌EPS一般包括多糖、蛋白質、核酸、脂質、磷脂和腐殖質等組分,其對生物膜內微生物有保護作用,可避免不利條件的影響。C及O大多集中在腐蝕產物(如Fe的氧化物)上,代謝產物如胞外聚合物上也有少量分布。生物膜與金屬存在相互作用,腐蝕產物也會存在于生物膜內,環(huán)境中的一些無機沉淀物(如沉積物或垢沉積)也是生物膜的一部分。

圖2接菌海水中X80鋼上生物膜的SEM像及元素面分布圖

Fig.2SEM image and distributions of elements on biofilm of X80 steel in inoculated seawater

圖3為X80鋼在接菌海水中及滅菌海水(對照組)浸泡14 d后腐蝕產物的Raman光譜。2種環(huán)境中在550 cm-1附近都出現了Raman峰,說明都有Fe3O4的產生,Fe3O4有較好的致密性和穩(wěn)定性,是電導體,可參與還原反應。接菌環(huán)境中試樣在208和282 cm-1出現Raman峰,且隨時間推移強度升高,峰位向右輕微偏移。208 cm-1對應FeS特征譜線,屬點陣模型。282 cm-1處光譜峰是結構無序峰,屬于非晶體硫化亞鐵微晶中Fe-S鍵不對稱伸縮振動模型,與文獻[33]報道FeS的Raman譜一致。此外,380 cm-1處Raman峰的出現對應γ-FeOOH的特征峰,說明γ-FeOOH等腐蝕產物的產生。接菌3 d時可檢測到FeSO4峰的存在,而后期該峰消失,說明SO42-濃度減少。

圖3滅菌及接菌海水中浸泡后X80鋼腐蝕產物的Raman光譜

Fig.3Raman spectra of the corrosion production of X80 steel after 14 d exposed in the sterile and SRB inoculated seawater

圖4分別為接菌環(huán)境中浸泡1、7和14 d的樣品表面S的XPS精細譜。結合能較高的軌道峰對應于S的氧化態(tài),結合能較低的軌道峰對應于S的還原態(tài)[34]。由擬合結果可知,隨時間延長,S譜峰值向低結合能方向移動,根據文獻[35,36,37,38,39,40,41]確定S的化合價態(tài),對應硫化物示于圖中。S元素化合價由+6價向-2價偏移,硫酸鹽或亞硫酸鹽被SRB還原為低價硫化物。且低價S軌道峰隨時間延長而增加,尤其第7 d后更為明顯,與菌數量變化相對應,說明接菌條件下SRB的生理活動導致S化合價態(tài)降低。精細譜擬合結果中,化合物子峰對應的面積與其含量正相關,通過歸一化處理定量分析,各硫化合物占比列于表1。如表1所示,實驗初期S主要存在于SO42-中,隨著時間的延長而增加,SO42-逐漸轉化為S2-,浸泡7和14 d后S2-的占比分別為30.48%和37.89%。

圖4接菌環(huán)境中浸泡1、7和14 d后樣品表面腐蝕產物中S的XPS精細譜

Fig.4S spectra of X80 steel after 1 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in the SRB inoculated seawater

浸泡3、7和14 d后SRB生物膜下試樣表面的腐蝕形貌示于圖5。可見,實驗3 d后試樣表面腐蝕輕微(圖5a),隨著浸泡時間的延長,開始出現明顯的局部腐蝕(圖5b)。有研究表明,低濃度的EPS在碳鋼表面吸附成膜抑制陰極反應過程,抑制碳鋼的腐蝕[42];高濃度的EPS對Fe2+具有絡合作用,能夠促進基體材料的陽極溶解[43]。實驗14 d時,出現一些較大的點蝕坑,整個表面出現大量的微小腐蝕坑(圖5c)。這說明連續(xù)完整的生物膜對均勻腐蝕有減緩作用,但促進了局部腐蝕的發(fā)生和發(fā)展,這是EPS及生物膜的屏障作用,不均勻分布[44],及其絡合Fe2+/Fe3+等綜合作用的結果。

圖5接菌海水中浸泡3、7和14 d 后SRB生物膜下X80鋼的腐蝕形貌

Fig.5Corrosion morphologies of X80 steel beneath SRB biofilm after 3 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in inoculated seawater

2.3 SVET測試

X80鋼表面SRB生物膜劃痕破損處微區(qū)SVET電流密度分布如圖6所示。SRB生物膜破損處基體為陽極區(qū),陽極電流密度最高達36 μA/cm2;而劃痕周圍生物膜為陰極區(qū),測試范圍內最大陰極電流密度為36 μA/cm2。SVET電流分布說明該MIC腐蝕體系中,生物膜與鋼基材間存在局部電化學耦合作用。這種局部耦合作用可能源于生物膜對Fe2+/Fe3+存在絡合/螯合作用[43],與金屬間存在直接或間接電子交互作用,促進基體的局部腐蝕。

圖6接菌海水中浸泡14 d后X80鋼表面SRB生物膜劃傷處的SVET電流分布圖(電流密度(i)正值為陽極區(qū),負值為陰極區(qū))

Fig.6SVET images of X80 steel on a scratch of SRB biofilm after 14 d exposed in inoculated seawater (The current density (i) is positive value in the anode region, whereas it is negative in the cathode region)

2.4 開路電位

圖7為X80鋼在滅菌和接菌海水中的EOCP隨浸泡時間的變化。滅菌海水中EOCP初始為-720 mV左右,1 d后下降到-735 mV左右,保持2 d后開始上升,恢復到-720 mV左右,這可能由于腐蝕產物積聚所致。接菌海水中,EOCP從初始的-730 mV降低到-738 mV,保持幾天后最終下降至-750 mV左右。可見,2種條件下的EOCP差異從第5 d開始變大,從第7 d開始EOCP保持恒定,且差異保持在30 mV左右,此時接菌試樣EOCP的變化與菌數量變化規(guī)律呈對應關系,這體現了SRB生物膜的電活性特征[7,19]。隨著浸泡時間的延長,腐蝕產物和代謝產物不斷積累,導電性增強,促進鋼表面電子轉移,導致EOCP降低。

圖7滅菌和接菌海水中X80鋼開路電位隨時間的變化

Fig.7Open circuit potential (EOCP) of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater as a function of time

2.5 電化學阻抗譜及極化電阻

圖8為滅菌和接菌海水中X80鋼的EIS結果。由Nyquist圖可見,由于培養(yǎng)基和腐蝕產物影響,滅菌海水中EIS從第3 d起阻抗弧半徑大幅增加(圖8a)。隨容抗弧增大,Bode圖中低頻阻抗模值|Z|0.01 Hz增大,最大相位角對應頻率減小(圖8c),Bode曲線向低頻移動,這與逐漸增多的腐蝕產物膜有關。Bode圖中|Z|0.01 Hz與Faraday過程相關,其絕對值與腐蝕速率呈負相關。

圖8滅菌海水和接菌海水中X80鋼的Nyquist和Bode圖

Fig.8Nyquist (a, b) and Bode (c, d) plots of X80 steel in the sterile seawater (a, c) and inoculated (b, d) seawater

由接菌海水中的Nyquist及Bode圖(圖8b和d)可見,前3 d阻抗大于滅菌條件,但3 d后低于滅菌海水中阻抗。第7 d起阻抗降低,反映了SRB對X80鋼腐蝕過程的促進作用。接菌的Bode圖中相位角峰值對應頻率不斷向低頻移動,移動范圍大于滅菌環(huán)境,一般認為這種相位角移動是試樣表面出現腐蝕的表現[45]。說明接菌海水中金屬與混合膜界面發(fā)生變化,SRB在浸泡實驗前期對腐蝕起抑制作用,后期卻促進腐蝕。

一般而言,EIS中的低頻電阻與Faraday反應過程有關,高頻電阻與溶液電阻有關。前者反映出鋼的腐蝕反應,后者代表了電解質的溶液電阻。故低頻阻抗模值可用于表征腐蝕過程的電化學動力學參數。本工作中,極化電阻Rp由下式獲得：

${?}_{\mathrm{p}}=|?{|}_{0.01\mathrm{Hz}}-|?{|}_{10\mathrm{kHz}}$(1)

式中,|Z|0.01 Hz和|Z|10 kHz分別為0.01 Hz和10 kHz處的阻抗模。由Stern方程[46]icorr=B×Rp-1(其中,icorr為腐蝕電流密度,B為常數)可見,Rp與腐蝕速率負相關,Rp-1可反映腐蝕速率的變化趨勢。

圖9為實驗過程中X80鋼的Rp隨時間的變化規(guī)律。可以看出,實驗初期,滅菌海水中X80鋼的Rp隨時間快速升高,至第3 d達到穩(wěn)定。接菌海水中,實驗前4 dRp基本穩(wěn)定,第5 d開始下降。實驗前3 d,接菌海水中Rp高于滅菌條件,即腐蝕速率低于滅菌條件;而3 d后,接菌海水中腐蝕速率高于滅菌條件;且浸泡實驗后期,接菌海水中的腐蝕速率約為滅菌海水中的10倍(Rp低約1個數量級)。各階段Rp、SRB數量及EOCP的變化呈對應關系,說明SRB達一定數量后其代謝產物、胞外聚合物等對試樣腐蝕速率起到促進作用。

圖9滅菌和接菌海水中X80鋼極化電阻(Rp)隨時間的變化

Fig.9Polarization resistance (Rp)vstime of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater

2.6 分析討論

生物膜是細菌在自然環(huán)境中的主要生存方式。微生物群落在水環(huán)境中通過浸潤表面、細胞生長、復制、吸附、微菌落形成和EPS發(fā)展等過程形成生物膜。圖10給出了海水中生物膜形成及X80鋼的腐蝕過程示意圖。實驗初期(圖10a)細菌主要以浮游態(tài)存在于溶液中,數量較少,但其逐漸吸附于鋼表面形成微生物菌落并生成EPS,EPS基質對腐蝕離子起一定阻隔作用;同時,EPS有電負性特征,能排斥侵蝕性負離子,抑制X80鋼的腐蝕。隨著細菌快速增殖,產生大量EPS,形成不均勻的生物膜(圖10b)。細菌的直接電子作用[20]和不均勻分布的生物膜引起濃差電池都可誘發(fā)和促進局部腐蝕。同時S2-與Fe2+反應生成FeS附著在基體表面,可與基體形成局部腐蝕電池,誘發(fā)點蝕坑的生成[34]。浸泡后期(圖10c),SRB代謝產物與腐蝕產物沉積在鋼表面,微生物菌落相互連接成完整生物膜,對均勻腐蝕過程有一定的抑制作用。但生物膜疏松多孔,其包裹的菌及大量的FeS,增加其導電性的同時還促進點蝕的發(fā)展,生物膜下酸量的增加也促進腐蝕。SVET結果也顯示,生物膜參與陰極過程,從而促進基體腐蝕的發(fā)展。

圖10含SRB海水中管線鋼表面生物膜形成及膜下MIC腐蝕過程示意圖

Fig.10Schematics of biofilm formation and corrosion process at the early stage (a), middle stage (b) and final stage (c) of X80 steel in SRB inoculated seawater

3 結論

(1) X80鋼在含SRB海水浸泡過程中,SRB細胞附著期及生物膜形成初期,EPS的屏障作用抑制X80鋼的腐蝕過程;但后期SRB的呼吸代謝活動導致X80鋼的自然腐蝕電位降低約20 mV,并顯著促進了管線鋼的局部腐蝕過程。

(2) 由EIS測試結果推測,含SRB海水中浸泡后期X80鋼的腐蝕速率較滅菌對照組高約1個數量級。SRB及其生物膜的作用致使X80管線鋼發(fā)生嚴重點蝕。

(3) 海水中SRB代謝過程促進S從SO42-向S2-轉變,并以FeS的形式在生物膜中沉積。生物膜作為陰極覆蓋在試樣表面,其與腐蝕產物間的絡合、螯合作用,細胞及其代謝產物、生物膜與金屬間存在直接或間接電子交互作用,這些作用相互協(xié)同耦合,促使生物膜下局部腐蝕的發(fā)生和發(fā)展。

來源--金屬學報